免疫熒光技術論文(2)
免疫熒光技術論文
免疫熒光技術論文篇二
免疫熒光雙標記技術檢測胎盤HBsAg┐抗┐HBs復合物
作者：王歆 ，徐德忠 ，劉蓬勃 ，李玉松 ，王素萍
【關鍵詞】 肝炎病毒
關鍵詞: 肝炎病毒，乙型;胎盤;抗原抗體復合物
摘 要:目的 探討乙肝病毒(HBV)以何種形式感染胎盤滋養層細胞. 方法 通過免疫熒光雙標記技術檢測12例血清HBsAg陽性母親的胎盤滋養層細胞HBsAg-抗-HBs復合物. 結果 血清學HBsAg陽性母親胎盤滋養層細胞中存在HB-sAg-抗-HBs復合物. 結論 提示HBV可能通過HBsAg與抗-HBs結合成復合物的方式進入胞內，導致胎盤屏障的第一層細胞受到HBV感染.
Keywords:hepatitis B virus;placenta;antigen-antibody complex
Abstract:AIM To find out which form Hepatitis B Virus(HBV)takes in the infection of the first layer cell of placenta barrier-trophoblast cells.METHODS HBsAg-anti-HBs complexes in HBsAg seropositive maternal placenta tissues were tested by double-labeling immunofluorenscence method visualized with laser scanning confocal microscope.RESULTS HBsAg-anti-HBs complexes were found mainly on tro-phoblast cells(TC)of HBsAg seropositive maternal placenta tissues.CONCLUSION HBsAg and anti-HBs are formed as HBsAg-anti-HBs complexes before entry into trophoblast
cells，which may result in the infection of the first layer cell of placenta barrier.
0 引言
乙型病毒肝炎是嚴重危害我國人民健康的傳染病.乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽性的孕婦可將乙肝病毒(HBV)經胎盤傳給胎兒，這種傳播稱為HBV的宮內傳播.現在普遍認為，胎盤在HBV宮內感染中起重要作用，認為HBV是先感染胎盤然后才引起胎兒感染的，我室既往用免疫組織化學和原位雜交方法對101例血清學HBsAg陽性胎盤組織檢測了HB-sAg和HBVDNA，其中滋養層細胞HBsAg陽性率為40.6%(41/101)，發現HBsAg主要分布于胞質[1] .國外學者在3例HBsAg慢性攜帶者胎盤絨毛基質血管內、滋養層細胞等檢測到HBsAg[2] .可見胎盤滋養層細胞受到HBV感染已毋庸置疑，但HBV是如何進入滋養層細胞的確切機制國內外尚未見報導.本研究通過對胎盤組織HBsAg-抗-HBs復合物的檢測，試圖闡明HBV是以何種方式跨越胎盤屏障進入滋養層細胞，為進一步揭示其宮內傳播機制提供依據.
1 材料和方法
1.1 材料
1997/1998年太原市傳染病院婦產科收集HBsAg陽性足月分娩產婦靜脈血3～5mL及胎盤組織，靜脈血分離血清后貯存于-20℃冰箱，統一進行HBsAg，HBsAg復查.用手術刀切取約1.5cm×1cm×2cm大小的胎盤組織(包括母面及胎兒面)浸入40g・L-1 多聚甲醛中固定后常規石蠟包埋.從以上收集的胎盤標本中選擇ABC和免疫熒光組織化學檢測為HBsAg陽性的胎盤標本12例.鼠抗-HBs購于武漢博士德生物工程有限公司(BioGenex產品，克隆號:A34060259P，Cat.No:MU364-UC);FITC標記的HBsAg自制(HBsAg購于北京醫科大學肝病研究所，從HBsAg攜帶者血漿中提取，經濃縮后，用FITC進行標記);生物素化兔抗鼠IgG購于博士德，產品編號:SA1072，Avidin標記的Texas Red購于基因公司(Molecular Probes產品，Catalog No:A-2665).用正常鼠血清代替鼠抗-HBs及FITC標記的HBsAg作為抗體特異性對照;用PBS代替抗-HBs及FITC標記的HBsAg作為空白對照;另外用血清學檢查HBV感染標記全陰性胎盤組織作為正常陰性對照.
1.2 方法
1.2.1 HBsAg的檢測
切片常規脫蠟(二甲苯、梯度乙醇)水化后，加入1∶50稀釋的鼠抗-HBs單抗，4℃過夜.PBS振洗后，再加入1:50稀釋的生物素化的兔抗鼠IgG37℃60min，最后加入1∶1000稀釋的Avidin標記的Texas Red，37℃孵育數小時，PBS充分洗滌，用無熒光緩沖甘油封片后，直接在激光共聚焦顯微鏡(LSCM)上觀察并拍照.所用LSCM型號為Bio-RadMRC-1024，用于Taxas Red的激發波長為568nm.
1.2.2 抗-HBs的檢測
切片同上脫蠟水化后，加入1∶20稀釋的FITC標記的HBsAg.37℃孵育數小時，PBS充分洗滌，激光共聚焦顯微鏡(LSCM)上觀察并拍照，用于FITC的激發波長為488nm.
1.2.3 HBsAg-抗-HBs復合物的檢測
切片經常規脫蠟水化后，加入3mol・L-1 尿素，室溫30min后，滴加1∶50/PBS正常血清封閉液，室溫10min.滴加1∶50稀釋鼠抗-HBs，4℃過夜.PBS振洗后，再加入1∶50稀釋的生物素化的兔抗鼠IgG37℃60min，最后加入1∶1000稀釋的Avidin標記的Texas Red和1∶20稀釋的FITC標記的HBsAg.37℃孵育數小時，PBS充分洗滌，用無熒光緩沖甘油封片后，直接在激光共聚焦顯微鏡(LSCM)上觀察并拍照.
2 結果
對血清學HBsAg陽性胎盤組織采用免疫熒光間接法檢測HBsAg，并在激光共聚焦顯微鏡上進行觀察.紅色熒光代表被檢測的HBsAg陽性.采用免疫熒光直接法檢測其抗-HBs，綠色熒光代表抗-HBs陽性.采用免疫熒光雙標記技術檢測HBsAg-抗-HBs復合物，除紅、綠色熒光外，黃色熒光是HBsAg和抗-HBs的重疊色，即二者在同一位置，說明HB-sAg和抗-HBs是以復合物的形式存在.觀察發現胎盤滋養層細胞HBsAg(Fig1)、抗-HBs(Fig2)、及HBsAg-抗-HBs復合物陽性(Fig3～5)，陽性物質位于細胞質.HBV感染標志全陰性胎盤作為正常陰性對照，未顯示陽性染色信號，空白及替代對照也未顯示陽性染色信號.
3 討論
胎盤是胎兒生長和發育的基礎，是胎兒與母體之間物質交換的場所，同時對病原微生物又具有屏障作用.我們近年來將分子流行病學研究引入HBV宮內感染的研究，用免疫組化和原位雜交方法檢測血清HBsAg陽性產婦胎盤細胞HBcAg和HBVDNA，發現胎盤各層細胞均存在HBV感染，而且從母面的蛻膜細胞到胎兒面的毛細血管內皮細胞HBV感染率有逐漸下降的趨勢，HBsAg、HBcAg和HBVDNA主要分布于胎盤細胞的胞質，偶見胞核和胞膜[1] .重復研究得到了相似的結論.結合國外的研究結果 [2] ，血清HBsAg陽性胎盤存在HBV感染已毋庸質疑.那么，HBV又是以何種形式感染胎盤細胞并存在于胎盤組織的呢?
我們曾用直接免疫熒光組織化學法對ABC法檢測為HBsAg陽性的胎盤組織和HBV血清學感染標志全陰性胎盤檢測抗-HBs，發現抗-HBs陽性部位分布于絨毛滋養層和絨毛間質和蛻膜細胞，與以上檢測的HBsAg的分布相一致，推測HBsAg與抗-HBs很可能是以免疫復合物的形式沉積于這些細胞.
近年來在許多病毒對人體感染的作用機制研究中，發現了一種抗體依賴的病毒感染的增強作用，即非中和性抗體介導的病毒感染增強作用[3] .有兩種形式:一種是病毒與IgG抗體結合成復合物，經細胞表面的Fc受體介導，以內化方式進入胞內;另一種是包被了IgM抗體的病毒與補體受體結合，進而增加病毒對靶細胞的感染.無論何種方式，病毒感染靶細胞都是以抗原-抗體復合物的形式，那么，乙肝病毒會不會也以此種方式感染胎盤細胞呢?
HBV進入人體后，可產生一系列針對病毒抗原成分的抗體，其中IgG型占大多數.這些抗體與人血液中HBV的不同抗原相結合，形成多種抗原-抗體免疫復合物，并可進一步活化補體.HBsAg-抗-HBs復合物就是其中的一種.研究發現，急性或慢性HBV感染患者體內，HBsAg-抗-HBs復合物中抗-HBs的主要亞型是IgG1和IgG4，而恢復期患者血清中游離抗-HBs主要亞型是IgG1和IgG3
[4] .胎盤絨毛間隙充滿母體血，絨毛滋養層細胞浸浴在HBV感染的母體血液中，從理論上講，為HBsAg-抗-HBs復合物沉積于絨毛滋養層細胞提供了條件，也是HBV侵入胎兒的關鍵部位.
我們應用免疫熒光雙標記組織化學技術，采用共聚焦顯微鏡觀察方法，檢測血清HBsAg陽性產婦胎盤組織HBsAg-抗-HBs復合物，HBsAg的檢測用紅色熒光顯示，抗-HBs用綠色熒光顯示，若復合物存在，應呈黃色熒光.結果發現HBsAg和抗-HBs以免疫復合物形式存在于絨毛滋養層和間質細胞，空白對照，替代對照及母親血清HBV感染標志全陰性胎盤未發現熒光染色，說明所檢測到的HBsAg-抗-HBs復合物非假陽性結果.
我們發現了胎盤在宮內傳播中的作用，并提出了HBV宮內傳播機制的假設[5] ，即通過以下兩條途徑:除血源性途徑外，還可通過HBV在胎盤組織內的“細胞傳遞”(cell transmission)途徑，即HBV可以從母體蛻膜細胞通過“逐層轉移”至胎兒絨毛毛細血管內皮細胞，導致胎兒感染.為探明“細胞傳遞”的具體機制，本次研究采用雙標免疫熒光組織化學法首先證實了胎盤滋養層細胞表面存在HBsAg-抗-HBs復合物，因而認為HBV感染滋養層細胞是以HBsAg與抗-HBs結合成復合物的形式，為進一步揭示宮內傳播機制提供了依據.
致 謝 太原傳染病院婦產科白鋼鉆主任等協助收集標本;病理教研室李玉松教授在實驗中給予指導;電鏡室王春梅主任給予共聚焦技術上的大力協助.
參考 文獻:
[1]YanYP，Xu DZ，Wang WL，Liu B，Liu ZH，Men K，Zhang JX，Xu JQ.The role of placenta in Hepatitis B virus intrauter-ine transmission [J].Zhonghua Fuchanke Zazhi(Chin J Obstet Gynecol)，1999;34(7):392-395.
[2]Lucifora G，Calabro S，Carroccio G，Brigandi A.Immunocy-tochemical HBsAg evidence in placents of asmptomatic carrier mothers [J].Am J Obstet Gynecol，1988;159:839-842.
[3]Liu PB.Antibody-dependent enhancement of virus infection [J].Guowai Yixue Bingduxue Fence(Foreign Med Sci:Virol)，2000;27(1):29-32.
[4]Rath S and Devey ME.IgG subclass composition of antibody to HBsAg in circulating immune complexes from patients with hepatitis B infection [J].Clin Exp Immunol，1998;72(1):164-167.
[5]Xu DZ，YAN YP，XU JQ，Wang WL，Men K，ZHang JX，Liu B，Liu ZHH，Wang FSH，Jiang ML，CHen XH.A molecular epidemiology study on risk factors and mechanism of HBV in-trauterine transmission [J].Zhonghua Yixue Zazhi(Natl Med J China)，1999;79(1):24-27.
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