生物選修一知識點整理(2)

生物選修一知識點整理

　　(2)稀釋涂布平板法統計樣品中活菌的數目的原理

　　當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活細菌。為了保證結果準確，一般設置3～5個平板，選擇菌落數在30～300的平板進行計數，并取平均值。統計的菌落數往往比活菌的實際數目低，因此，統計結果一般用菌落數而不是活菌數來表示。

　　采用此方法的注意事項：1.一般選取菌落數在30~300之間的平板進行計數

　　2.為了防止菌落蔓延，影響計數，可在培養基中加入TTC(在計數瓊脂中加入適量的TTC(0.5% TTC 1ML加到100ML瓊脂中),細菌菌落長成紅顏色,對去除食品本底顆粒物干擾非常有意義).

　　3.本法僅限于形成菌落的微生物

　　設置對照

　　設置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。對照實驗是指除了被測試的條件以外，其他條件都相同的實驗，其作用是比照試驗組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實是所測試的條件引起相應的結果。

　　實驗設計

　　實驗設計包括實驗方案，所需儀器、材料、用具和藥品，具體的實施步驟以及時間安排等的綜合考慮和安排。

　　(1)土壤取樣：同其他生物環境相比，土壤中的微生物，數量最大，種類最多。在富含有機質的土壤表層，有更多的微生物生長。從富含有機物、潮濕、pH≈7的土壤中取樣。鏟去表層土，在距地表約3～8cm的土壤層取樣。

　　(2)樣品的稀釋：樣品的稀釋程度將直接影響平板上生長的菌落數目。在實際操作中，通常選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養，以保證獲得菌落數在30~300之間、適于計數的平板。

　　測定土壤中細菌的數量，一般選用104 105 106

　　測定放線菌的數量，一般選用103 104 105

　　測定真菌的數量，一般選用102 103 104

　　(3)微生物的培養與觀察

　　不同種類的微生物，往往需要不同的培養溫度和培養時間。細菌30~37℃ 1~2天

　　放線菌25~28℃ 5~7天 霉菌25~28℃ 3~4天

　　每隔24小時統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，這樣可以防止因培養時間不足而導致一樓菌落的數目。一般來說，在一定的培養條件下(相同的培養基、溫度及培養時間)，同種微生物表現出穩定的菌落特征。形狀、大小、隆起程度、顏色

　　疑難解答

　　(1)如何從平板上的菌落數推測出每克樣品中的菌落數?

　　統計某一稀釋度下平板上的菌落數，最好能統計3個平板，計算出平板菌落數的平均值

　　每克樣品中的菌落數=(C/V)*M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數

　　課題三 分解纖維素的微生物的分離

　　纖維素，一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是地球上含量最豐富的多糖類物質。

　　纖維素與纖維素酶

　　(1)棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產物，木材、作物秸稈等也富含纖維素。

　　(2)纖維素酶是一種復合酶，一般認為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維素最終被水解成葡萄糖，為微生物的生長提供營養。

　　纖維素分解菌的篩選

　　(1)篩選方法：剛果紅染色法。能夠通過顏色反應直接對微生物進行篩選。

　　(2)剛果紅染色法篩選纖維素分解菌的原理

　　剛果紅是一種染料，它可以與像纖維素這樣的多糖物質形成紅色復合物，但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發生這種反應。當我們在含有纖維素的培養基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養基中的纖維素形成紅色復合物。當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅-纖維素的復合物就無法形成，培養基中會出現以纖維素分解菌為中心的透明圈。這樣，我們就可以通過是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌。

　　分離分解纖維素的微生物的實驗流程

　　土壤取樣→選擇培養(此步是否需要，應根據樣品中目的菌株數量的多少來確定)→梯度稀釋→將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養基上→挑選產生透明圈的菌落

　　(1)土壤采集 選擇富含纖維素的環境。

　　(2)剛果紅染色法分離纖維素分解菌的步驟 倒平板操作、制備菌懸液、涂布平板

　　(3)剛果紅染色法種類

　　一種是先培養微生物，再加入剛果紅進行顏色反應，另一種是在倒平板時就加入剛果紅。

　　課題延伸

　　對分解纖維素的微生物進行了初步的篩選后，只是分離純化的第一步，為確定得到的是纖維素分解菌，還需要進行發酵產纖維素酶的實驗，纖維素酶的發酵方法有液體發酵和固體發酵兩種。纖維素酶的測定方法，一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產生的葡萄糖進行定量的測定。

　　疑難解答

　　(1)為什么要在富含纖維素的環境中尋找纖維素分解菌?

　　由于生物與環境的相互依存關系，在富含纖維素的環境中，纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環境。

　　(2)將濾紙埋在土壤中有什么作用?你認為濾紙應該埋進土壤多深?

　　將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集，實際上是人工設置纖維素分解菌生存的適宜環境。一般應將紙埋于深約10cm左右腐殖土壤中。

　　(3)兩種剛果紅染色法的比較

　　方法一是傳統的方法，缺點是操作繁瑣，加入剛果紅溶液會使菌落之間發生混雜;其優點是這樣顯示出的顏色反應基本上是纖維素分解菌的作用。方法二的優點是操作簡便，不存在菌落混雜問題，缺點是由于纖維素和瓊脂、土豆汁中都含有淀粉類物質，可以使能夠產生淀粉酶的微生物出現假陽性反應。但這種只產生淀粉酶的微生物產生的透明圈較為模糊，因為培養基中纖維素占主要地位，因此可以與纖維素酶產生的透明圈相區分。方法二的另一缺點是：有些微生物具有降解色素的能力，它們在長時間培養過程中會降解剛果紅形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易區分。

　　(4)為什么選擇培養能夠“濃縮”所需的微生物?

　　在選擇培養的條件下，可以使那些能夠適應這種營養條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應這種營養條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。